کلون و بیان فاکتور نکروز دهنده تومور آلفا (tnf-?)

سایتوکاین ها خانواده ای از فاکتورهای رشد هستند که توسط سلول های سیستم ایمنی ترشح می شوند. این خانواده شامل اینترلوکین ها (il)، اینترفرون ها (ifn)، فاکتور نکروز کننده تومور (tnf)، کموکاین ها و سایر فاکتورهای رشد می باشند. فاکتور نکروز کنند? تومور، بعنوان یک مولکولی با خصوصیات آنتی توموری است که عمدتاً توسط ماکروفاژهای تحریک شده با باکتری ترشح می شود. علیرغم ابنکه مقادیر محدودی tnf-? از منابع طبیعی آن بدست می آید اما مقادیر زیادی از فرم محلول آن (مورد نیاز برای مطالعات ساختاری و عملکردی) را می توان به آسانی توسط تکنولوژی dna نوترکیب به دست آورد. بنابراین ترجیح داده می شود برای تولید این پروتئین نوترکیب از سیستم های ساده میکروبی و نیز گیاهان استفاده گردد. در اینجا به منظور مطالعه بیان tnf? انسانی، cdna کد کنند? htnf? حاصل از rt-pcr ی mrna سلول های ماکروفاژ انسان، با استفاده از پرایمرهای اختصاصی از قبل طراحی شده تکثیر گردید. محصول pcr خالص سازی شده، در سایت برشی ecorv که در داخل ناحیه کد کننده مقاومت به تتراسایکلین در pbr322 بود، الحاق شد. سرانجام به منظور بیان، ژن هدف در پلاسمید تحت کنترل سیگنال های رونویسی و ترجمه قوی پروموتور باکتریوفاژ t7 کلون گردید به این ترتیب که وکتور نوترکیب و نیز هر دو با آنزیم های ndei-hindiii بریده شده و قطعهdna bp 478 حاصل از برش pbrtnf در pet21a(+) خطی شده، اتصال و سپس در e. coli dh5? ترانسفورم شد. پس از بررسی صحت کلونینگ (توسط تکنیک pcr و آنزیم های برشی) و توالی یابی قطعه کلون شده، بیان سیتوپلاسمی htnf? نوترکیب در سویه bl21(de3) e.coli از طریق تکنیک های sds-pageو نیز وسترن بلاتینگ مورد تایید قرار گرفت.